产品说明
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试剂盒组成
运输与保存
低温运输， -20°C 保存，避免反复冻融。
产品简介
Seamless Cloning master mix 是一种即用型无缝克隆产品。无缝克隆是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以同时将 1-4 个 DNA 片段克隆到任何载体中。反应时间短至 20 分钟，阳性率达到 95%以上。只需插入的 DNA 片段末端与载体末端具有 15-25 个同源碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。
操作步骤
1. 载体线性化 采用酶切或 PCR 扩增方法将载体线性化。
a. 酶切
载体酶切一定要完全，否则未切开的载体会影响后续的阳性克隆鉴定。 选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可。但为了提高阳性率，我们建议您采取双酶切方法获得线性化载体。 酶切获得的载体可以是 3’ 突出或 5’ 突出， 也可以是平末端线性化载体。但 3‘突出或平末端的线性化载体可以提高克 隆的效率。酶切获得的线性化载体需进行纯化后使用。
b. PCR
选取合适的位点，设计正向和反向引物，引物长度一般在 18-20bp 左右，一般载体长度均大于 3kb，建议用高保真的聚 合酶扩增为了避免模板质粒 DNA 对后续试验的影响，建议载体酶切后再用 PCR 扩增，自连背景更低，阳性率更高。
2. 目的DNA片段的PCR扩增 扩增目的 DNA 片段的引物 5'末端要附加与载体末端相同的碱基序列 (15-25 bp) ，因此，PCR 每条引物长度至少在 35-40bp，包括 5’端与载体同源的 15bp 以及目的片段特异性序列 20-25 bp。
（注意事项：如果是表达载体克隆构建，引物设计完全后，请注意检查读码框的正确。）
3. 引物设计方法 引物设计是很重要的，在设计引物时同样要遵循引物设计的基本原则，只不过上下游引物要加上 15-25 bp 的载体同源序 列。引物序列包括是：5’-15-25bp 同源序列-所需酶切位点序列-特异性引物序列-3’。 载体酶切后有 5’端突出、3’端突出或平末端三种情况。
注：15 bp 同源序列不要求严格从载体最末一个碱基计算，但载体末端非同源序列过长会降低重组效率。建议末端非同源序 列不超过 30 bp。
4. 目的片段与载体的重组
将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到PCR管中进行重组反应。以20 ul反应体系为例
注：目的片段与载体的摩尔比建议在 2：1-3：1 之间。
当插入片段总和＞5 kb 的时候，可适当延长孵育时间到 30-50 min。
5. 转化
a. 加入 4 μl 的反应液到感受态细胞中，轻弹数下，置冰上孵育 30 分钟。
b. 42°C 水浴中热激 90 秒后快速放入冰上 5 分钟。
c. 加入 500 μl SOC 液体培养基，37°C 孵育 45-60 分钟。
d. 4000 rpm 离心 3 分钟收集菌体，根据需要将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上。
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