产品说明
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产品包装和保存条件
4℃干燥避光保存,有效期一年(推荐)。-20℃干燥避光保存, 有效期二年。
注:做完细胞增殖检测一般还会做细胞凋亡检测,汉恒还提供 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒。
一、 实验原理
CCK-8细胞增殖检测试剂盒是一种基于WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的快速灵敏度试剂盒。WST-8属于MTT的升级产品,工作原理为:在电子耦合试剂存在的情况下,WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)(图1-2) ,其颜色的深浅与存活细胞数目的增殖成正比,与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450 nm波长处测定OD值,可以间接反映活细胞的数量。CCK-8法应用非常广泛,如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。
二、CCK-8方法的优势
表1 CCK-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较
注:1、酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰;
2、本试剂盒细胞毒性非常低,因此加入WST-8显色后,可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。
三、细胞活性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液(100 μl/孔)。将培养板放在培养箱中预培养一段时间(37℃, 5% CO2)。
2、向每孔加入10 μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
5、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μl0.1 M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
四、 细胞增殖-毒性检测
1、在96孔板中接种细胞悬液(100 μl)。将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃,5% CO2)。
2、向培养板加入10 μl不同浓度的待测物质。
3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6、12、24或48小时)。
4、向每孔加入10 μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡,它们会影响OD值的读数)。
5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
7、若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μl - 0.1M的HCl溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
注:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
五、注意事项
1、建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
2、有条件的情况下建议采用多通道移液器,可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时,建议斜贴着培养板壁加,不要插到培养基液面下加,容易产生气泡,会干扰OD值读数。
3、白细胞可能需要培养较长时间。
4、当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的 接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8 溶液。
5、如果没有450 nm的滤光片,可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片,但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。
6、培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不会对检测造成影响。
活力计算:
细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK-8 溶液 溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK-8 溶液 溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力
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